2018调控Gal—9/Tim—3通路对小鼠胶原诱导性关节炎作用的研究
[摘要] 目的 探讨激活或阻断Gal-9/Tim-3信号通路对小鼠胶原诱导性关节炎的影响及其机制。 方法 6～8周龄雌性BALB/c小鼠30只，建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型，造模后第7天加强免疫。于加强免疫前1 d随机分为激活组、阻断组、对照组，每组10只，分别经尾静脉输注半乳糖凝集素-9（Gal-9）、阻断剂Tim-3单抗、PBS。造模后28 d观察三组小鼠踝关节变形程度，记录关节炎指数，ELISA法检测血清抗炎因子白介素-10（IL-10）、转化生长因子（TGF-）水平，RT-PCR检测踝关节滑膜组织辅助性T细胞（Th17）、调节性T细胞（Treg）标志性蛋白ROR-t、FoxP3表达量。 结果 加强免疫后，三组小鼠出现不同程度关节变形，造模后第28天关节炎指数：激活组为（7.121.53）分、阻断组为（13.822.12）分、对照组为（10.881.84）分，差异有高度统计学意义（P0.01）；血清IL-10、TGF-水平：激活组[（12.882.23）、（27.614.52）ng/L]明显高于对照组[（7.491.70）、（21.332.07）ng/L]（P0.01），阻断组[（4.261.79）、（12.352.42）ng/L]明显低于对照组（P0.01）；RT-PCR结果显示：ROR-t mRNA在滑膜组织的表达情况激活组明显低于对照组（P0.01），阻断组明显高于对照组（P0.01）；FoxP3 mRNA表达情况激活组明显高于对照组（P0.01），阻断组明显低于对照组（P0.01）。 结论 激活Gal-9/Tim-3通路可缓解小鼠胶原诱导性关节炎，阻断该通路则加重炎性反应，作用机制可能与该通路抑制Th17，活化Treg有关。 [关键词] 类风湿性关节炎；胶原诱导性关节炎；辅助性T细胞；调节性T细胞；信号通路 [中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（a）-0004-04 Effects of regulation of Gal-9/Tim-3 pathway on murine collagen-induced arthritis YANG Xiao PENG Hao ZHOU Jianlin FANG Hongsong CHEN Sen Department of Orthopaedics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430000， China Objective To explore the alleviatory effects of Gal-9/Tim-3 pathway on murine collagen-induced arthritis （CIA）. Methods Thirty SPF female BALB/c mice （age 6-8 weeks） were used in the study. Mice model of rheumatoid arthritis （RA） was established by subdermal injections of collagen Ⅱ， on the 7th day， strengthened immunity. The day before strengthened immunity， mice were randomly divided into three groups： activation group， control group and blockage group， with 10 mice in each group， transfusion through caudal vein was performed with Gal-9， Tim-3 mAb and PBS respectively， 28 days after first immunization， the severity of CIA was evaluated with regards to arthritic index （AI）， sera levels of IL-10， TGF- by ELISA， expressions of biomarkers of T helper 17 cells （Th17） and regulatory T cells （Treg） by RT-PCR. Results After second immunization， the ankle joints of CIA mice began to deform with mild to severe arthritis. On the 28th day after first immunization， the AI of activation group was （7.121.53） scores， control group was （10.881.84） scores， and AI of blockage group was （13.822.12） scores， the differences were statistically significant （P0.01）. Compared with control group， the sera concentrations of IL-10 and TGF- of activation group were significantly higher （P0.01） while those of blockage group were significantly lower （P0.01）. The results of RT-PCR showed： the expression of ROR-t in synovial tissue of activation group was lower than that of control group （P0.01）， and ROR-t expression of blockage group was higher than that of control group （P0.01）； the expression of FoxP3 in synovial tissue of activation group was higher than control group （P0.01）， and FoxP3 of blockage group was lower than control group （P0.01）. Conclusion Murine CIA may be markedly ameliorated by acticvation of the Gal-9/Tim-3 pathway and exacerbated by blockage of it， possibly through the tunnel of inhibiting Th17， stimulating Treg and up-regulating the expression of anti-inflammatory cytokines， which can lead to autoimmune tolerance. Rheumatoid arthritis； Collagen-induced arthritis； T helper cell； Regulatory T cell； Immune tolerance 类风湿性关节炎（rhematoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫病，以滑膜、软骨和软骨下骨进行性破坏为特征，导致关节变形，致残率极高。RA发病机制尚未完全明确，但国内外研究证实，滑膜组织炎性渗出和免疫细胞募集是核心环节。在RA异常免疫过程中，辅助性T细胞17（T helper 17 cell，Th17）和调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）比例失衡，被认为是RA发生发展的重要因素。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule-3，Tim3）表达于免疫细胞表面，调控细胞增殖、分化和凋亡，半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）是其天然配体。在克罗恩病、多发性硬化、自身免疫性肝炎、1型糖尿病等自身免疫病的动物模型中，激活Gal-9/Tim-3通路可诱导免疫耐受，作用机制可能与Tim-3诱导Th17凋亡，刺激Treg增殖，重建Th17/Treg平衡有关；但该通路在RA病变中的作用，尚缺少随机对照试验证实。本实验建立小鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型，模拟人类RA并给予Gal-9/Tim-3通路激活剂和阻断剂分别干预，验证该通路对CIA的作用及可能机制，为寻找治疗RA的新靶点提供一定理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 6～8周龄雌性BALB/c小鼠30只，SPF级，购于武汉大学动物实验中心（合格证号：No.42000500006615），饲养于武汉大学人民医院动物房。 1.2 主要试剂及仪器 鸡Ⅱ型胶原（CⅡ）、完全弗氏佐剂（CFA）、冰醋酸购于Sigma公司，重组小鼠Gal-9和抗小鼠Tim-3单抗（Tim-3 mAb）购于PeproTech公司，白介素（IL）-10和转化生长因子-（TGF-）酶联免疫吸附法试剂盒购于RD公司，PCR仪购于北京东胜公司。 1.3 小鼠CIA造模及分组 将鸡Ⅱ型胶原（CII）加入0.1 mol/L冰醋酸，冰浴中搅拌溶解，配成2 mg/mL溶液，4℃冰箱过夜后，将CⅡ溶液与完全福氏佐剂（CFA）按1∶1等体积混合制成乳化剂；取CⅡ乳化剂50 L，于小鼠背部及尾根部多点皮下注射，1周后按上述方法、 本文由提供，毕业论文 网专业代写论文和论文代写以及发表论文服务，欢迎光临.cOm相同剂量加强免疫1次；初次免疫后第6天，即加强免疫的前1天，按照尾静脉输注不同药物进行分组：①激活组（n=10）：尾静脉输注含Gal-9（5 g/mL）的PBS 100 L；②阻断组（n=10）：尾静脉输注含Tim-3 mAb（10 g/mL）的PBS 100 L；③对照组（n=10）：尾静脉输注PBS 100 L。 1.4 关节炎指数（arthritic index，AI） 采用0～4级评分法，0分：无红肿；1分：趾关节轻度肿胀；2分：趾关节及足跖肿胀；3分：踝关节以下足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部足爪肿胀。AI为4只足爪的累计评分，数值越高，代表关节炎越严重，初次免疫后每周记录1次，共记录4次。 1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）法测抗炎因子 初次免疫后第28天对每只小鼠眼眶取血0.8～1.0 mL，全血37℃恒温箱静置1 h，放入离心管，2000 r/min离心15 min，吸取上清，按照ELISA试剂盒说明测IL-10和TGF-浓度。 1.6 PCR测Th17和Treg标志性蛋白ROR-t、Fox P3 1.6.1 引物 由PubMed基因库获取全基因序列，由北京擎科新业公司设计并合成。ROR-t mRNA上游引物：5'-CATTCAGTATGTGGTGGAGTTTGC -3'，下游引物：5'-GACTA GGACGACTTCCATTGCTC -3'，扩增片段为109 bp；FoxP3 mRNA上游引物：5'-GTACACCC AGGAAAGACAGCAAC-3'，下游引物：5'-CTCGAAGACCTTCTCACAACCA-3'，扩增片段为104 bp；以持家基因-actin为内参，上游引物：5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，下游引物：5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'，扩增片段为240 bp。 1.6.2 RT-PCR 造模后第28天颈椎脱臼法处死小鼠，取左前足踝关节滑膜，Trizol法提取组织总RNA，以GeneCopoeia公司逆转录试剂盒合成cDNA；PCR扩增后取5 L产物加入1 L DNA上样缓冲液，2%琼脂糖凝胶电泳检测样品，每份样品行3次重复检测，Quantity One 4.62图像分析软件行光密度值测定，ROR-t和FoxP3的表达量以目的片段与内参-actin的相对比值表示。 1.7 统计学方法 采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用2检验。以P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 AI情况 三组小鼠初次免疫后，四只足爪均出现轻度肿胀，局限于趾间关节，药物干预及加强免疫后，激活组肿胀加重不明显，阻断组关节肿胀最严重，出现强直畸形，对照组介于二者之间。初次免疫后第28天，即加强免疫后第21天，激活组、阻断组、对照组AI值分别为（7.121.53）、（13.822.12）、（10.881.84）分，差异有高度统计学意义（P0.01）。见图1。 与对照组比较，**P0.01 图1 加强免疫后三组小鼠的关节炎指数 2.2 抗炎因子情况 ELISA检测小鼠血清IL-10和TGF-浓度，激活组IL-10、TGF-分别为（12.882.23）、（27.614.52）ng/L，阻断组为（4.261.79）、（12.352.42）ng/L，对照组为（7.491.70）、（21.332.07）ng/L，激活组浓度均明显高于对照组，阻断组均明显低于对照组，差异有高度统计学意义（P0.01）。见图2。 与对照组比较，**P0.01；IL-10：白介素-10；TGF-：转化生长因子- 图2 三组小鼠抗炎细胞因子浓度 2.3 Th17和Treg标志物情况 2.3.1 PCR RT-PCR扩增ROR-t和FoxP3的电泳结果显示，无引物二聚体，无非特异扩增，测序后结果与基因库相比较，确定为所需目的基因。见图3。 2.3.2 PCR光密度值测定 三组小鼠滑膜组织ROR-t mRNA的相对表达量：激活组为（0.2650.074），阻断组为（0.9720.143），对照组为（0.5360.125），激活组较对照组降低（P0.01），阻断组较对照组增高（P0.01）；FoxP3 mRNA相对表达量：激活组为（1.2030.228），阻断组为（0.135 0.026），对照组为（0.4190.102），激活组较对照组增高（P0.01），阻断组较对照组降低（P0.01）。见表1。 表1 小鼠滑膜组织ROR-t和FoxP3相对表达量（xs） 注：与对照组比较，**P0.01 3 讨论 RA是以多关节受累为主要表现的自身免疫病，滑膜组织分泌大量细胞因子，募集免疫细胞；各种炎症因子与细胞互相激活，导致RA不断进展，迁延不愈。幼稚T细胞（naive T cell，Tn）受到诱导后分化为Th1、Th2和Th17，其中Th17在介导自身免疫性炎症的过程中发挥重要作用。研究发现，Th17主要分泌IL-17，起到募集炎症细胞的作用，而ROR-t是Th17的特异性标志物，在自身免疫疾病中均发现IL-17和ROR-t表达量升高，与Th17活动增强有关。Treg由Tn分化而来，是负性免疫调节细胞，具有抗炎和抑制自身免疫功能，FoxP3是其特异性标志物。由此可见，Th17与Treg是调控自身免疫反应的两种关键细胞，Th17/Treg平衡对于维持免疫稳态意义重大。 Tim-3为近年新发现的受体分子，主要表达于Th1、Th17、Treg等细胞，具有调控细胞增殖、分化及凋亡的作用。在诸多自身免疫病的动物模型中，当Tim-3与其天然配体Gal-9结合后，激活的Gal-9/Tim-3通路可诱导免疫耐受，缓解炎性反应。作为公认理想的RA动物模型，小鼠CIA成功模拟了RA的病理生理特点和免疫学微环境，为探讨Gal-9/Tim-3通路对RA的影响提供必需条件。本实验发现，阻断组小鼠关节病变较对照组严重，而激活组较对照组减轻，证明阻断Gal-9/Tim-3通路会加重CIA炎症，激活该通路则可有效遏制关节炎进展。有文献报道，Gal-9/Tim-3通路使抗炎因子IL-10和TGF-表达增加，拮抗炎症介质作用，减轻组织病变；本实验以ELISA法测三组小鼠血清IL-10和TGF-浓度，证实了该结论。关于抗炎介质表达增加的途径，很可能是活化的Tim-3分子多途径诱导Th17凋亡，激活Treg，触发了强大的免疫耐受效应。本实验中，激活组滑膜组织ROR-t表达下降，FoxP3表达上升，而阻断组ROR-t上升，FoxP3下降，说明激活Gal-9/Tim-3通路确实能恢复Th17/Treg平衡，重建免疫稳态。总之，本实验发现激活Gal-9/Tim-3通路对CIA具有缓解作用，并证实其机制很可能是通过恢复Th17/Treg平衡，上调抗炎因子表达，从而实现自身免疫耐受，这为人类RA的治疗提供了新的靶点。 [参考文献] Alghasham A，Rasheed Z. 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