2018黄芪皂苷I对Th1免疫反应的调节效应及机制研究
摘要：目的研究黄芪皂苷I的免疫调节作用以及作用的分子机理。方法构建丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖细胞模型，测定黄芪皂苷I对ConA诱导T淋巴细胞增殖和LPS诱导B淋巴细胞增殖反应，构建anti-CD3 mAb抗体诱导T淋巴细胞增殖，RT-PCR检测黄芪皂苷I对IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达。结果黄芪皂苷I 在30nM显著促进ConA 刺激T淋巴细胞增殖，差异有显著性意义（P http://关键词：黄芪皂苷I；T淋巴细胞；Th1免疫反应；IFN-γ；T-bet
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）12-0072-03
【Abstract】Objective： To study the immunomodulatory effect of stragaloside I and its molecular mechanism. Methods： The splenic lymphocyte proliferation model induced by mitogen was established to determine the response of astragaloside I to T lymphocytes proliferation induced by ConA and B lymphocytes proliferation induced by LPS. T lymphocyte proliferation induced by anti-CD3 mAb antibody was established. RT-PCR was used to determine astragaloside I to the genetic expression of IL-2， IFN-γ and T-bet mRNA. Results： Astragaloside I significantly promoted the proliferation of T lymphocyte stimulated by ConA at 30 nM， and the difference was significant （P医学院左爱学博士提供，受试药物呈白色粉末状，纯度>99%，用DMSO作为溶剂配置成5 mg/mL储存液，-20℃保存备用，临用前用RPMI-1640培养液稀释成相应浓度；RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司（life Technologies，Grandisland，NY，USA）；胎牛血清（fetal bovine serum）购自Hyclone 公司（Logan，Utah，USA）；刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）购自Sigma公司（St.Louis.MO，USA）；Trizol裂解液购置天根生化（北京）科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.3主要仪器离心机购自德国Thermo Scientific Heraeus；二氧化碳培养箱和生物安全柜均购自美国Thermo-fisher；Epoch连续波长酶标仪购自美国Bio-Tek公司。
2实验方法及评价 2.1脾淋巴细胞的制备小鼠脱脊椎处死，无菌取其脾脏。将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于1200 rpm离心5 min。弃去上清，沉淀加入红细胞裂解液（每个脾脏约1 mL），混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1～2次后，用含10%FBS的RPMI-1640将细胞调至所需浓度。
2.2MTT法测定丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能小鼠脾脏淋巴细胞（4×105个/孔）接种于96孔板，加入不同浓度的受试物，同时加入ConA（终浓度1μg/ml）或LPS（终浓度10μg/ml），另设无刺激剂的本底对照。于37℃，5% CO2培养箱中作用48h，MTT法检测丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能。
2.3RT-PCR检测IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达因表达，用序列单环己基铵ed ymmunomodulatin-脾淋巴细胞（5×106个/孔）接种于anti-CD3 mAb抗体（5μg/ml）包被的24孔板中，加入黄芪皂苷II（30nM），另设相应溶媒对照和无刺激本底对照，于37℃，5% CO2培养箱培养16h后，收集细胞，Trizol一步抽提法提取总RNA，反转成cDNA，PCR检测检测IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达，电泳和成像。特异基因引物序列如下：
基因PCR引物序列IL-2：（sense）5’-TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG-3’；（anti-sense）5’-GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC-3’；IFN-γ：（sense）5’-ATGAACGCTACACACTGCATC-3’；（anti-sense）5’-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3’；T-bet：（sense）5’-CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC-3’；（anti-sense）5’-ACGTGTTTAGAAGCACTG-3’；β-actin：（sense）5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；（anti-sense）5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’；2.3统计学分析所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P0.05）。
3.2黄芪皂苷I对IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达的影响见图2。RT-PCR方法检测黄芪皂苷 II对IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表达情况。结果显示，anti-CD3 mAb刺激16h后能够显著诱导IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表达，黄芪皂苷 I体外用药能够显著上调IFN-γ和T-bet的mRNA表达，而对IL-2表达水平无明显影响，说明黄芪皂苷I 在基因转录水平可能通过促进T-bet的转录而诱导IFN-γ的表达。
4讨论
在机体的细胞免疫中T细胞发挥着重要的作用，T淋巴细胞不仅是细胞免疫功能的承担者，而且也是免疫应答的调节者，其中以辅助性T淋巴细胞（Th）和抑制性T 淋巴细胞（Ts）对免疫网络的调节作用至为重要，参与多种自身免疫性疾病和肿瘤免疫过程。IFN-γ是Th1型细胞释放的重要的细胞因子，对Th1细胞的分化起着重要作用，同时其可诱导巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的产生，促进NO的合成，是IFN-γ抗肿瘤作用重要的分子机制之一。IFN-γ能活化NK细胞，提高其对靶细胞的杀伤功能。
T 细胞激活后分化发展成为Th1、Th2、Th17和Treg等T淋巴细胞亚群受到不同转录因子的调节。T-bet属于T-box家族的转录因子，选择性表达于Th1细胞，作为Th1特异的转录因子能诱导Th1型细胞因子的产生，在Th1细胞的分化中起着决定作用。T细胞激活后产生两种重要的细胞因子IL-2、IFN-γ，它们对促进和扩大免疫反应有很强的功能。IL-2是T细胞增殖所必需的T细胞生长因子，具有很强的免疫刺激作用和抗肿瘤活性。我们的实验结果表明，黄芪皂苷I显著促进anti-CD3 mAb诱导的T淋巴细胞增殖。在mRNA水平上，黄芪皂苷 I 也能够显著上调 IFN-γ、T-bet 的mRNA表达水平。研究已证实，黄芪皂苷能够显著激活 CD45 PTPase 酶活性。在分子水平，黄芪皂苷能够显著促进CD45 PTPase作用底物P56LCK（Tyr505）去磷酸化。基于以上实验结果，推测黄芪皂苷 I作为CD45 PTPase激活剂，在细胞水平可能通过激活CD45 PTPase，参与TCR介导的T淋巴细胞信号转导，从而激活下游相关信号通路，引起Th1特异性转录因子T-bet转录激活，促进T 淋巴细胞增殖和IL-2、IFN-γ的产生。该研究丰富和发展黄芪“健脾补中，益卫固表”功效的科学内涵，为传统中药的现代研究提供新的研究思路和方法。
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（收稿日期：2017-11-10）
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