2018调胃消痞方对功能性消化不良大鼠胃肠动力及胃肠激素的影响
摘要：目的观察调胃消痞方对功能性消化不良（Functional Dyspesia，FD）大鼠胃肠动力及血清胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）和血管活性肠肽（VIP）含量及胃窦组织Ghrelin表达的影响，明确其药效及其可能的作用机制。方法运用夹尾刺激加不规律饮食制备FD肝郁脾虚动物模型，测定各组大鼠体重、胃残留率及肠推进率，酶联免疫法（Elisa）检测FD大鼠血清中MTL、GAS、VIP表达的改变，HE染色观察胃窦黏膜病理变化；免疫组化染色观察胃窦组织中Ghrelin的表达。结果与正常对照组相比，模型组大鼠体重、小肠推进率明显降低，胃残留率明显增多，血清MTL、GAS含量显著降低，VIP含量显著增加，胃窦组织中Ghrelin的表达明显减少（P http://关键词：调胃消痞方；功能性消化不良；胃肠动力；胃肠激素
中图分类号：R-33文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）12-0063-04
功能性消化不良（Functional Dyspesia，FD）为临床常见消化系统疾病之一，具有慢性、复发性和难以缓解的特点，总患病率为11.5%～14.5%。随着生活节奏的加快，FD患病率逐年升高，严重影响人们的生活质量。目前西医治疗主要以促胃动力药为主，但不适用于所有的FD患者。FD是消化病领域的研究热点和难点。中医药在治疗胃肠运动障碍方面疗效肯定。调胃消痞方是云南省名中医龙祖宏教授基于50多年临床经验总结出的治疗FD的有效方，临床疗效明确，组方为党参，茯苓，延胡索，川楝子，薏苡仁，炒枳壳，甘草等，全方具健脾疏肝，清热消痞之功效。本方在疏肝、健脾同时兼顾其标辅以除湿热，但尚未从实验动物学角度阐释其有效性及作用机制。本研究拟复制肝郁脾虚FD动物模型，从胃肠动力功能障碍及胃肠激素改变水平探讨调胃消痞方有效性及初步作用机制，为其临床运用提供科学依据，揭示中医疏肝、理气、健脾、除湿热之治法治疗FD的有效性现代生物学科学内涵。
1材料
1.1动物8周龄SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±15）g，由成都达硕实验动物有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK（川）2015-030。大鼠饲养于IVC动物实验室，温度20～25℃（日温差≤3℃）；湿度40%～70%；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60dB。实验动物使用许可证：SYXK（滇）K2013-0002，发证单位：昆明市科学技术局。
1.2药物与试剂实验用调胃消痞方采用党参，茯苓，延胡索，川楝子，薏苡仁，炒枳壳，甘草等颗粒剂（由江阴天江药业有限公司生产）；枸椽酸莫沙必利片剂，由成都康弘药业集团有限公司生产（国药准字：H20031110），批号：150519，5mg/片；MTL、VIP、GAS酶联检测试剂盒购自江苏卡尔文生物有限公司，批号：20150802B；Rabbit anti-Ghrelin由北京博奥森生物技术有限公司（CatNo：bs-0791R）提供；DAB染色液（增强聚合物法）试剂盒由福州迈新生物公司提供，（CatNo：1603080015），批号：1603080015。
1.3仪器高速离心机，德国 Thermo Scientific Heraeus；Epoch 连续波长酶标仪，美国 Bio-Tek公司；ASP300S 全自动脱水机、RM2235轮转切片机、EG1150H+EG1130C 组织包埋机、DM2500正置显微镜+图文系统（德国Leica）
2方法
2.1FD大鼠模型复制及分组给药SD大鼠按体重随机分为：正常对照组、模型组、莫沙必利组、调胃消痞方高、中、低剂量组，每组10只。除正常对照组外，其余各组老鼠按照采用“夹尾激怒加不规律饮食法”制造FD模型：各组老鼠均给予正常喂水，单日喂食，双日禁食同时用长海绵钳夹大鼠尾巴远端1/3处，以不破皮为度，令其暴怒，寻衅与其他大鼠撕打，以激怒全笼大鼠。每次刺激30 min，30 min内连续不断地刺激，随着打斗的加剧，大鼠可能被抓伤，为避免炎症干扰，可用0.5%的碘伏涂擦受伤部位，以控制感染，每隔3h刺激1次，每日2次。造模同时，各组大鼠灌胃给药，调胃消痞方高、中、低剂量组根据原方比例配置，分别按生药剂量为36.6、18.3、9.15 g/kg；莫沙必利组予莫沙必利5 mg/kg；空白对照组及模型组以等体积生理盐水灌胃，每天给药1次，持续给药21d。
2.2营养性半固体糊的制备取羧甲基纤维素纳 5 g，溶于 100 mL蒸馏水中，分别加入奶粉 8 g，糖4 g，淀粉 4 g，碳素墨水 2 mL，搅拌均匀，配制成约 150 mL的黑色半固体糊状物，冰箱冷藏，用时恢复至室温。
2.3标本采集及检测方法
2.3.1一般状态观察每日观察大鼠日常的精神状态、毛色、活动度、对束缚的反应程度、体重、食量、粪便变化等全身情?r。
2.3.2胃排空率及小肠推进率检测实验结束后，禁食不禁水24 h，每只大鼠按灌服营养性半固体糊2 mL，30 min 后予以 10% 水合氯醛腹腔内注射麻醉，常规消毒后用手术剪刀沿腹正中线剪开腹腔，于腹主动脉采血后，结扎贲门及幽门处，截取胃囊。滤纸擦拭干后称重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干，再次称重。以前后两次称重得出的差值记为胃内残留物重，计算胃内残留物质占所给营养糊的重量百分比即为胃残留率。胃内残留率（%）=胃内残留物重（g）/灌胃的营养糊重（g）×100%，小肠总长度为幽门到回盲部的距离，小肠推进长度为幽门至黑色营养性半固体糊前沿的距离。小肠推进率（%）=（小肠推进长度/小肠总长度）×100% 2.3.3MTL、VIP、GAS的测定采用腹主动脉采血，静置、3000 rpm/min离心15 min后取上清液，按照elisa检测试剂盒说明书方法检测各组大鼠血清中MTL、VIP、GAS的含量。
2.3.4胃窦黏膜组织病理情况的观察取出胃体并清洗称量后，每组分别选取5只大鼠取胃窦部一段组织，10%中性甲醛固定，按照HE染色法常规步骤脱水、包埋、切片、染色后观察胃窦组织病理情况改变。
2.3.5免疫组化测定胃窦组织Ghrelin的表达采用增强聚合物法按试剂盒操作说明书进行，在实验过程中加空白对照（以PBS代替各种一抗）。经去除内源性过氧化物酶，抗原修复后，一抗孵育过夜，一抗稀释比例为（1：200），二抗孵育，DAB显色封片后显微镜下观察，以胞浆内Ghrelin阳性产物呈深黄色或棕黄色者为强阳性，黄色为阳性，浅黄色为弱阳性，与背景同色者为阴性。由医学图文分析软件设置相等的检测窗口面积为平均阳性细胞面积。随机选相互不重叠的 5个视野于200倍下计算Ghrelin阳性细胞数。
2.4数据处理计量资料用平均数±标准差（x±s）表示，方差齐时组间比较采用LSD检验，方差不齐时组间比较采用Dunnett’s T3检验；偏态分布用秩和检验。P统计学差异。见表1。
3.3调胃消痞方对FD大鼠胃肠运动功能的影响实验结果表明，模型组大鼠胃内残留率显著升高，肠推进率显著降低；与模型组比较，莫沙必利组及调胃消痞方高剂量组可显著促进大鼠胃排空、肠推进，大鼠胃内残留率明显降低，肠推进明显增加，差异具有统计学意义；消痞方中剂量组仅对肠推进具有明显增加作用；消痞方低剂量组对胃内残留率、肠推进率影响无明显统计学差异。见表2。
3.4调胃消痞方对FD大鼠血清MTL、VIP、GAS含量的影响Elisa检测结果显示，模型组大鼠血清MTL、GAS含量显著降低，VIP含量显著增加，与正常对照组比较，差异具有统计学意义。经药物干预后，莫沙必利组、调胃消痞高、中剂量组MTL含量较模型组显著增加，调胃消痞方中剂量组血GAS含量较模型组明显增加；同时，莫沙必利组及调胃消痞方高剂量组血清VIP含量较模型组显著降低。调胃消痞方低剂量组对MTL、VIP、GAS含量均无明显影响。见表3。
3.5调胃消痞方对FD大鼠胃窦黏膜组织病理改变的影响经HE染色、显微镜下观察胃窦黏膜形态改变。结果显示：各组大鼠胃窦黏膜均未出现明显病理变化，无萎缩、糜烂、增生、炎症细胞明显渗出等病理变化。见图1。
3.6调胃消痞方对FD大鼠胃窦黏膜组织Ghrelin的表达的影响模型组大鼠胃窦组织Ghrelin阳性细胞数较正常组明显减少，经药物干预后，莫沙必利及调胃消痞方各剂量组Ghrelin表达均显著增加，以高剂量组作用显著。见表4。图2。
4讨论
FD为多发性、无任何器质性病变的常见消化系统疾病，以餐后饱胀、上腹痛、嗳气等一种或多种持续或反复发作的症状为其主要临床特征。研究显示，FD可能为胃肠动力障碍、心理因素、胃肠激素分泌异常多因素综合作用的结果，而胃肠动力不足与FD发病最为密切，胃肠排空延迟则是FD发病的主要病理学基础。心理因素与FD发病亦密切相关，现代研究表明：有23.6%的FD患者有焦虑抑郁症状。在焦虑、抑郁状态下脑肠轴可使胃肠运动功能减弱或抑制，胃肠分泌功能紊乱，胃肠激素（或脑肠肽）分泌减少。其临床主要表现为胃排空障碍。
胃肠激素MTL广泛分布于消化系统及中枢神经系统，可刺激胃蛋白酶分泌，提高胃肠道张力、收缩力，促进胃肠运动，加速胃排空。由胃窦及十二指肠黏膜G细胞分泌的GAS可促进胃体及幽门收缩进而加速胃排空，还可刺激胃酸、胃蛋白酶分泌，提高消化功能。VIP为一种抑制胃肠运动的神经递质和脑肠肽激素，通过食物对胃肠道刺激、体液因素等多种途径释放，可舒张胃肠平滑肌及括约肌。Ghrelin为一?N内源性脑肠肽及重要神经递质，参与调节胃肠运动功能及胃酸分泌。而胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、血管活性肽（VIP）等胃肠激素的异常参与FD发病过程。
中医学众多医家对FD病机研究认为，FD的基本病机为“脾虚气滞”，诱因为饮食、情志、湿热、感寒等。无论何种病因、病理过程，均可致脾胃虚弱、湿浊内生，湿浊郁久化热，湿热阻滞中焦，该病多见本虚标实之证，脾虚为本，湿热为标，临床多见为寒热错杂证，治疗时当以疏肝健脾为主，同时兼顾症候辅以平调寒热等治法。中医通过运用疏肝理气法可促进胃排空及小肠推进。
调胃消痞方云南省名中医龙祖宏教授50多年多年以来治疗功能性消化不良的经验方，全方由四君子汤、金铃子散加味化裁而来，全方共奏补脾、舒肝、调气机、除湿热之功。方中党参、茯苓、白术、甘草共凑益气健脾之功，延胡索、川楝子具疏肝泄热、活血止痛之功，清热除湿组合之竹茹清热化痰、除烦止呕，蒲公英清热解毒，薏苡仁健脾利湿，清热排脓；炒枳壳、苏梗理气行气滞宽中，气行、湿化则热孤；炒神曲健脾和胃，消食调中。补虚而不忘祛邪，达标本兼顾之效。本研究复制肝郁脾虚FD模型，实验结果显示，FD大鼠经调胃消痞方干预后，胃排空及肠推进明显增加，提示调胃消痞方具促进FD大鼠胃肠动力，改善胃肠功能障碍的作用，为进一步明确对FD大鼠胃肠激素的影响，经检测FD大鼠血清MTL、GAS、VIP含量，结果表明模型组大鼠血清MTL、GAS含量显著降低，VIP含量显著增加。调胃消痞高、中剂量组MTL含量较模型组显著增加，调胃消痞方中剂量组血GAS含量较模型组明显增加；调胃消痞方高剂量组血清VIP含量较模型组显著降低。调胃消痞方低剂量组对MTL、VIP、GAS含量均无明显影响。同时免疫组化检测结果显示调胃消痞方可上调胃窦黏膜Ghrelin表达，提示，调胃消痞方在一定剂量范围可通过增加MTL、GAS含量，降低VIP含量，上调Ghrelin表达而改善胃肠道排空障碍，改善FD症状。调胃消痞方临床有效性可能与其调节以上胃肠激素水平，改善胃肠动力密切相关。同时本研究也进一步证实中医疏肝、健脾、理气、除湿热之治法治疗FD的有效性。本方的具体作用机制等尚待进一步研究。
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（收稿日期：2017-09-22）
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