2018上海市宝山区2014年非伤寒沙门菌血清型及分子分型分析
摘要：目的 分析宝山区2014年沙门菌主要优势血清型，主要脉冲场凝胶电泳（PFGE）型别，探讨宝山区沙门菌污染的同源性。http://
方法 采集超市、菜市场出售的畜禽肉类、水产品，采集菜市场的禽类粪便，以及监测点医院的病人肛拭（2014年一起食物中毒事件相关样品），根据感染性腹泻诊断技术：WS271―2007和《上海市感染性食源性疾病监测方案（2010年）》的检测方法进行沙门菌的分离鉴血清型分型，根据《上海市腹泻病监测实施方案》（2013年）的要求进行PFGE分子分型，采用Bio Numerics version 6.0 软件分析比较同源性。
结果 共分离出72株沙门菌，主要优势血清型是肠炎、鼠伤寒、德尔卑，PFGE分子分型共有31个带型，食物中毒事件中的病人、从业人员PFGE分子分型为同一带型，与菜市场采集的解冻鸡肉、猪肾也为同一带型，但是这三者之间的传播关系尚待进一步考证。
结论 宝山区2014年沙门菌血清型以肠炎、鼠伤寒、德尔卑为主，PFGE带型呈多样型。加强食品中细菌污染物的PFGE持?m性监测，有助于了解和掌握食品中沙门菌的污染。
关键词： 沙门菌； 血清型； PFGE； 同源性中图分类号： R 195 文献标志码： A
Abstract： Objective Discuss the main advantage of Salmonella serotypes in Baoshan District in 2014，The main type pulsed field gel electrophoresis （PFGE），Investigate the homology of the baoshan district salmonella contamination.
Methods Acquisition of supermarkets， markets selling livestock and poultry， aquatic products， Collect market poultry excrement， As well as the monitoring of hospital patients anus swabs， Happened in 2014 samples of food poisoning event correlation， According to the WS271―2007 （infectious diarrhea diagnosis technology） And “Shanghai foodborne infectious disease monitoring programme？ （2010） in the detection method for the identification of salmonella and serotype of diagnosis， A total of 72 strains of salmonella isolated， According to the requirements of Shanghai diarrhoeal disease monitoring scheme for the PFGE molecular classification， using Bio Numerics version 6.0 software homology analysis comparison.
Results Baoshan district 2014 main superiority serotype is the enteritis， mouse typhoid， del low is given priority to， found the PFGE molecular classification of 31 belt type.
Conclusion Food poisoning patients， practitioners in the classification for the same type area， and collect the vegetable market thaw chicken， pig kidney for same type area but also how the spread of the relationship between the three remains to be proven. Baoshan district PFGE belt type and serum type varied type， PFGE continuous monitoring need to be improved in the future.
Keywords： Salmonella； Serotype； PFGE； Homology
非伤寒沙门菌是常见的食源性致病菌，可引起发热、腹泻，甚至败血症等症状，全球每年约有15万人死于非伤寒沙门菌感染。沙门菌在自然界中的存活能力较强，不仅感染人畜，还极易污染食品、水源等。食品传播是人类感染沙门菌的主要途径，其中肉类和禽类产品是主要的污染源。为了解上海宝山区食源性非伤寒沙门菌的主要血清型及分子分型分布，宝山区对2014年检出的非伤寒沙门菌进行了血清分型和应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）开展分子分型分析。
1 材料与方法
1.1 材料
实验菌株共72株，菌株来源中腹泻病人23株，食物中毒病人11株，食品中分离15株，病人粪便23株。PFGE 分类用分子量标准参考菌株为沙门菌H9812，由上海市疾病预防控制中心提供。沙门菌诊断血清来自丹麦（SSI 60种）。SBG沙门菌增菌液、沙门菌显色培养基（CAS平板）、XLD培养基、M-H琼脂、肠道综合发酵双管糖等均由上海科玛嘉微生物技术有限公司提供。EDTA、Tris-HCL由上海生工提供，GelRed染液由美国Biotium公司提供，限制性内切酶Xba I由日本Takara公司提供，Seakem Gold Agarose由美国Lonza公司提供。 1.2 仪器
CHEF Mapper脉冲场凝胶电泳系统和GEL DOC凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司设备，比浊仪为法国生物梅里埃公司设备。
1.3 方法
1.3.1 病原学检测 沙门菌检测根据感染性腹泻诊断技术：WS271―2007和《上海市感染性食源性疾病监测方案》（2010）中有关病人、食品和粪便环境标本检测程序开展样品处理，增菌分离，菌株初筛和血清分型鉴定。将样品接种于XLD平板划线分离，在（36±1）℃环境中培养18～24 h，同时采用SBG增菌液增菌后，转种于CAS平板，在（36±1）℃环境中培养18～24 h。挑取单个可疑菌落（XLD培养基上中间有黑心，边缘半透明的可疑菌落）CAS平板上有紫红色、圆形可疑菌落，分别接种于肠道综合发酵双管糖，在（36±1）℃环境中培养18～24 h，并做革兰染色试验，清凝集试验，确定为沙门菌后，再进行PFGE分子分型试验。
1.3.2 PFGE分子分型试验
① 制胶。将72株沙门菌和沙门菌H9812（分子量Marker）接种到M-H琼脂上， 37℃培养16～18 h。刮取菌苔，调节浊度，吸取400 μL细菌悬浊液注入1.5 mL eppendorf管中， 每管加入20 μL蛋白酶K，立即取等量1% Seakem Gold（1%SDS）胶加入菌液，混合均匀； 将混合液加入模具中，置室温环境中15 min后待凝固备用。
② 裂解菌体细胞。将胶块转移至装有5 mL CLB的screw-cap管中，并加入25μL（浓度为20 mg/mL）的蛋白酶K，54℃水浴2 h以上。
③ 洗胶。从水浴孵育的摇床中取出screwcap管并倒掉CLB；每管加入10 mL预热纯水，50℃，10 min水浴摇床，倒掉纯水，重复清洗1 次，再倒掉纯水。加入15 mL预热的TE，50 ℃，15 min水浴摇床，倒掉管中TE，用TE 重复清洗3 次，每次15 min。
④ 酶切。倒掉样品管中的TE缓冲液，加入已经配制好的Xba I酶切溶液， 37℃水浴2 h以上。
⑤ 电泳。将胶块取出，冷却至室温。吸出酶切混合液，再加入200 μL 0. 5×TBE缓冲液平衡5 min 2次后。取出胶块并固定在梳子齿上，室温风干4 min左右。将1% SKG制胶溶化并平衡至56℃时，缓缓倒入胶槽。电泳槽中加入0.5×TBE约2 L，盖好盖子。设置冷凝温度为14℃，电泳参数（2.16～63. 8 s，17.5 h）。
⑥ 染色。电泳结束后，将胶放入装有400 mL EB溶液的染色盒中，染色30 min后，倒掉盒中的EB，加入纯水，进行脱色，脱色30 min后倒掉纯水，进行读胶。
⑦ 读胶。将胶块放置凝胶成像系统中拍摄图像。
1.4 统计学分析
使用BioNumerics version 6.0?件进行图像处理和聚类分析。
2 结果
2.1 72株沙门菌血清分型
分型结果：肠炎沙门菌22株，鼠伤寒沙门菌16株，德尔卑沙门菌10株，阿尔巴尼沙门菌8株，阿贡纳、婴儿、山夫登堡沙门菌分别为5株、3株、2株，其他（恩昌加、罗森、斯坦利、汤卜逊、乌盖利、B群）各1株，共计72株。
2.2 血清分型结果与PFGE分子分型结果比较
血清分型结果与PFGE分子分型结果的比较见表1。
3 讨论
PFGE重复性好、分辨率强而被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”，在溯源分析中具有重要作用。肠炎沙门菌主要有2个PFGE带型（SH0021和SH0190），在2014年的5―8月发现有相同带型的病人在上海市第一人民医院宝山分院就诊，但由于是散发病例，未予预警。在同年11月暴发的一起食物中毒事件中，发现9例食物中毒病人和2例从业人员都为同一带型SH0021，与在7、8月采集于大昌菜市场的解冻鸡肉、猪肾也为同一带型（SH0021），为可疑食物，但是这3者之间如何传播的关系还有待进一步流行病学调查。鼠伤寒沙门菌发现有9个PFGE带型，呈现多样性，发现上海市第一人民医院宝山分院6、10月的2名门诊病人带型一致（SH0117），未发现食品或动物粪便与病人完全一致的带型。 德尔卑沙门菌有7个PFGE带型，也呈现多样性，发现6月1例病人与采集自大昌菜市场的新鲜猪肉和半成品牛肉的带型完全一致（SH0053）。
持续数月在大昌菜市场禽类粪便检测的鼠伤寒、阿贡纳和阿尔邦尼沙门菌均具有同源性。采集于大昌菜市场2014年7月8日的动物粪便（鸡粪）中发现5株阿贡纳沙门菌条带是完全一致，可能不同鸡笼、鸡舍被同一污染源污染，故实际鸡粪为同源，但不排除采集过程导致的同一克隆，即同一鸡笼或鸡舍的鸡粪被反复采集。采集于大昌菜市场2014年9月、10月鸡粪中发现高度相似的阿尔邦尼沙门菌2个带型（SH0061）3株和（SH0062）1株，相同（SH0013）带型的阿尔邦尼沙门菌4株。7―8月5株鼠伤寒沙门菌同一带型（SH0102）。2014年沙门菌的血清型共有13种，表明宝山区沙门菌血清型多样性的特征。但由于人源样品大多是监测点医院的肠道门诊散发病例，尽管就诊时也根据要求登记可疑的食物史，虽然进行流行病学的回顾性调查，但是未能进行相关的食品或环节采样和沙门菌的检测，无法得知病原菌的真正来源。非人源的样品由于人力、财力所致，基本仅限于几个农贸市场，有局限性，不能明确是本文中人源样品的可疑食物史来源，这可能是导致人源和非人源的血清型不完全一致的原因。
肠炎沙门菌是美国、加拿大、澳大利亚、泰国等地主要的致病血清型，也是我国食物中毒事件中检出频率最高的血清型，同时我们还发现了鼠伤寒粗糙型，尽管在历年文献中早已有报道此菌的存在，但在宝山区还是最近几年才有发现。鼠伤寒沙门菌的粗糙型菌落为扁平、干燥，中央有皱褶，接种环挑起时有拉丝感，甚至将整个菌落挑起，诱导后无第2项。因此，我们在检测过程中注意不要漏检，关注此菌的多种菌落形态，此菌在沙门菌属诊断抗原表中表述为“鼠伤寒沙门菌存在i单相变种”，即H第二相诱导结果阴性。宝山区沙门菌的检出食品以猪肉和猪内脏阳性居多，这可能由于在家畜体表、被毛、消化道、上呼吸道等器官总是有微生物存在，而在屠宰、加工、贮藏、运输、销售等环节都极易使猪肉及内脏受到污染所致，和工业化国家，受感染的动物肉类和蛋类食品是人沙门菌病的主要感染源比较一致。禽类和禽类粪便中检出情况也比较高，和禽类自然带菌、农贸市场环境比较混杂，也可能存在交叉感染的情况有关。
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（收稿日期：2016-07-18）
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