2018缬沙坦抑制高糖环境下足细胞损伤的机制探究
[摘要] 目的 通过观察缬沙坦对高糖环境下足细胞EMT过程中ILK、MMP9、NEPH1 mRNA表达的影响，探讨缬沙坦保护受高糖损伤足细胞的可能机制。 方法 将培养分化成熟的足细胞随机分为5 mmol/L 葡萄糖培养组（对照组）和25 mmol/L 葡萄糖培养组（高糖组），在25 mmol/L葡萄糖培养液中分别加入2×10-7 mol/L （低Val组）、2×10-6 mol/L （中Val组）和2×10-5 mol/L（高Val组）缬沙坦。体外培养48 h后，倒置显微镜观察细胞形态，并采用PCR半定量分析技术检测ILK、MMP9、NEPH1的表达。 结果 高糖组细胞NEPH1的表达较对照组显著减少（P0.05）。 结论 缬沙坦可能通过抑制ILK通路保护高糖环境下受损的足细胞。http://
[关键词] 缬沙坦；足细胞；高糖；上皮-间充质转分化
[中图分类号] R587.2；R692 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）33-0035-05
Objective To observe the effect of valsartan on ILK， MMP9 and NEPH1 mRNA expression during the EMT process of podocytes under high glucose environment， and to explore the possible mechanism of valsartan in protecting the podocytes from high glucose. Methods The differentiated mature podocytes were randomly divided into 5 mmol/L glucose culture group （control group） and 25 mmol/L glucose culture group （high glucose group）. 2×10-7 mol/L valsartan （low Val group）， 2×10-6 mol/L valsartan （medium Val group） and 2×10-5 mol/L （high Val group） valsartan were added to 25 mmol/L glucose culture medium. After 48 hours of in vitro culture， the cell morphology was observed by inverted microscope， and the expression of ILK， MMP9 and NEPH1 were detected by PCR semi-quantitative analysis. Results The expression of NEPH1 in high glucose group was significantly lower than that in control group（P0.05）. Conclusion Valsartan may protect the podocytes from the high glucose environment by inhibiting the ILK pathway.
Valsartan； Podocytes； High glucose； Epithelial-mesenchymal transdifferentiation
糖尿病?I病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要并发症之一，属于微血管病变的一种，以蛋白尿为主要表现。蛋白尿的形成，其组织学基础可归纳为足细胞足突融合、脱落，致使肾小球滤过屏障受损。足细胞通过已分化上皮细胞向间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），失去nephrin、P-cadherin和NEPH1-3等上皮细胞特征性蛋白的表达，而上调间充质细胞样表型标志蛋白如整合素连接激酶（ILK）、成纤维细胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein l，FSP-1）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）等的表达，是损伤肾小球滤过屏障的关键因素。足细胞的EMT过程存在并影响着DN的进程。研究证实，当足细胞的EMT过程被抑制，足细胞其正常的上皮细胞表型能得以恢复，蛋白尿也随之减少。如何逆转该过程，是目前众多学者的研究热点。 2016版《糖尿病肾病防治专家共识》中，推荐ACEI/ARB作为DN控制血压的药物应用，在肯定其降压效果的同时，鉴于临床文献的缺乏，对其降低尿微量白蛋白的作用不置可否。缬沙坦作为ARB类代表性的药物，在DN的治疗中应用多年，其降低尿微量白蛋白的疗效有目共睹。除降压效果之外，缬沙坦是否能有效减少DN蛋白尿的形成、减慢肾小球滤过率的下降， 延缓DN的进展，从而保护肾脏功能，这值得我们进一步探讨。
本文通过观察ILK、MMP9、NEPH1在不同浓度缬沙坦干预高糖环境下足细胞中的表达变化，探讨缬沙坦除降压之外，治疗DN的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1材料来源
1.1.1 细胞与试剂 小鼠的肾小球足细胞由英国伦敦大学国王学院Guy' s 医院赠送，缬沙坦原粉由诺华生物制药有限公司提供；10%胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，γ-干扰素购自美国 PEPRO Tech公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，Trizol提取试剂盒来自美国Invitrogen公司。引物合成PRIMER5.0引物软件设计，由上海生物工程公司合成。
1.1.2 仪器 ABI7900 实时定量荧光 PCR 仪器（美国 ABI 公司）；X70光学显微镜（日本Olympus公司）；PowerPac Basic WB电泳仪（美国BIO-RAD公司产品），GEL DOC凝胶成像系统。
1.2方法
1.2.1 细胞培养 常规操作复苏小鼠肾小球足细胞，加入含有5 mL 10% FCS1640培养液的25 cm2培养瓶中培养，每培养瓶中含有γ-干扰素500 U，培养箱孵育条件为33℃、5%CO2，细胞增殖后进行传代，细胞传代用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化细胞，传代至所需细胞数后，转移入含有5 mL 10%FCS1640培养液的25 cm2培养瓶中培养，每瓶不加干扰素，培养箱孵育条件变为37℃、5%CO2，培养至细胞形态呈“树枝状”，即足细胞分化成熟。
1.2.2 实验分组 取50 mL细胞培养瓶接种已分化成熟的足细胞，通过RandA 1.0软件完全随机分组法，将足细胞分为5 组，每组5 瓶，A组（对照组D-葡萄糖5 mmol/L）、B组（高糖组，D-葡萄糖25 mmol/L）、C组（低Val组，25 mmol/L D-葡萄糖+缬沙坦 2×10-7 mol/L）、D组（中Val组，25 mmol/L D-葡萄糖+缬沙坦 2×10-6 mol/L）和E组（高Val组，25 mmol/L D-葡萄糖+缬沙坦 2×10-5 mol/L）。在37℃、5%CO2的培养箱孵育48 h后，在倒置显微镜下观察足细胞形态变化，并以RT -PCR 半定量法检测各组足细胞相关蛋白的表达。
1.2.3 RT-PCR半定量法检测相关蛋白RNA表达 先采用 Trizol 试剂和氯仿按照常规方法抽提肾小球足细胞总 RNA ，测定每个 RNA 样品的浓度（单位为μg/mL）后，在逆?D录酶M -MuLV 催化下合成 cDNA；在PCR仪上按照特定扩增条件进行 PCR扩增 反应。
25 μL反应体系配比：dNTP 0.5 μL ，10 ×buffer 2.5 μL，引物正反义链各10 pmol， TaqDNA 聚合酶1.5 u，cDNA 1 μL，加DEPH水至终体积25 μL。阴性对照即不加入cDNA。聚合酶链反应（ PCR） 引物正反义链序列见表 1。
1.2.4 扩增反应条件 在94℃ 2 min进行预变性后，根据不同RNA产物采取预实验中取定的退火温度及循环数。见表2。
1.2.5 电泳及凝胶半定量分析 制取1.7%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭），将各PCR产物与DNA Marker（购自上海生物工程公司）置入凝胶标本孔中，在0.5%TBE液中在100 V/cm下电泳 30 min，通过BIO-RAD凝胶成像分析系统分析成像，再以Quantity-one进行光密度值测定，将NEPH1、ILK、MMP9的条带光密度值与内参GAPDH的条带的光密度值进行比较，该光密度比值即代表各相关蛋白的mRNA表达的相对值，提示该种蛋白mRNA的表达情况。
1.3 统计学方法
利用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料以（x±s）表示，进行单因素方差分析（ANOVA），两两比较在方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane检验。P0.05）。见表3、图2、3。
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