2018雌激素调节大鼠颏舌肌生理功能的中枢途径研究
[摘要]目的：探?雌激素对SD大鼠颏舌肌功能影响的中枢途径。方法：选取7周龄雌性SD大鼠50只，随机分为空白组、对照组、100nmol组、1μmol组、2μmol组。利用脑立体定位图谱确定第四脑室及舌下神经核团位置，通过第四脑室注射溶液建立不同水平的雌激素模型，使用玻璃微电极检测舌下神经核团放电特征，BL-420E+生物机能实验系统检测SD大鼠颏舌肌肌电活性。结果：舌下神经核放电频率及幅值：空白组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；2μmol组>1μmol组>100nmol组>对照组，组间差异有统计学意义（P0.05）。肌电活性（平均频率、最大频率、积分幅度、最大幅值）：空白组与对照组无显著性差异（P>0.05），2μmol组>1μmol组>100nmol组>对照组，组间具有极显著性差异（P http://[关键词]阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征；雌激素；舌下神经核；电生理；颏舌肌
[中图分类号]Q579.1+3 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）09-0045-03
The Study of Estrogen Effect on Rat Genioglossus Physiological Function by
Central Pathway
LI Huan，SUN Bing-cheng， LIU Lei，GONG Xu-yan， OU Sa-ma， HOU Yu-xia
（Department of Orthodontics， Stomatology Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004，Shaanxi， China）
Abstract： Objective To investigate the effects of estrogen on central pathway of genioglossus muscle function in SD female rats. Methods Fifty female SD rates of 7-week old were randomly divided into five groups blank group，control group，100nmol group， 1μmol group and 2μmol group.The location of the fourth ventricle and hypoglossal nucleus was determined by stereotaxic localization of the brain.Different levels of estrogen were injected to the fourth ventricle of the animal models. Hypoglossal nerve nuclei electrical discharges were detected using glass microelectrode. Genioglossus muscle activity was detected by using BL-420E+ biological experimental system. Results There was no significant difference between the blank group and the control group in the discharge frequency and amplitude of hypoglossal nucleus （P>0.05）， while 2 μmol group is greater than 1μmol group， 100 nmol group than control group but lower than 1μmol group .No significant changes of action potential amplitude were observed among five groups （P>0.05）. It had no significant difference between the blank group and the control group of the EMG activity （average frequency， maximum frequency， integral amplitude and maximum amplitude） （P>0.05）， while 100nmol group was higher than control group （P Key words：obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome； estrogen； hypoglossal nucleus； electrophysiology； genioglossus
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是一种常见且具有一定潜在危险的睡眠障碍性疾病，主要表现为睡眠中反复出现上气道阻塞，导致以呼吸停止或低通气为特征的呼吸紊乱现象。颏舌肌是维持上气道通畅的关键肌肉，被称为上气道的“安全肌”。舌下神经核是颏舌肌的支配核团，位于第四脑室底延髓后段，支配颏舌肌的节律运动与紧张性收缩，维持上呼吸道的稳定性。流行病学调查显示男性发病率约为女性的2～3倍，绝经后女性发病率明显高于绝经前，给予雌激素替代治疗（HRT）后OSAHS的发病率有所降低。提示雌激素在预防或减少OSAHS的发病中，可能具有一定的保护作用。Shortt CM等研究表明，雌激素能够提高慢性间歇低氧环境下去卵巢大鼠颏舌肌的抗疲劳性。大鼠舌下神经核内存在雌激素受体，提示舌下神经核是雌激素的潜在靶组织，雌激素可能通过舌下神经核间接影响颏舌肌功能。而Shortt CM等研究并未从舌下神经核深入研究雌激素影响颏舌肌功能的中枢机制。
本实验通过改变SD大鼠颅内雌激素水平，检测雌激素对舌下神经核放电特征及颏舌肌肌电活性的影响，从中枢途径探讨雌激素对颏舌肌功能影响的生物学机制，为OSAHS的临床预防和治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料
1.1.1 实验动物：7周龄雌性SD大鼠（体质量300±25g）50只，由西安交通大学医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（陕）2012-003。
1.1.2 主要试剂和仪器：10%水合氯醛（上海实验试剂有限公司）、2%膀胺天蓝（美国Sigma公司）、17β-雌二醇（美国Cayman公司）、人工脑脊液（ACSF，pH：7.2～7.4，自己配制）、大鼠脑立体定位仪（DW-2000，成都泰盟软件有限公司）、颅内注射导管（深圳瑞沃德生命科技有限公司）、微电极（MP-300，成都泰盟软件有限公司）、生理信号采集处理系统BL-420（成都泰盟软件有限公司）、哺乳类动物手术器械（上海浦夏医疗器械有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 颅内第四脑室注射雌激素：腹腔注射10%水合氯醛（0.4ml/100g）麻醉大鼠，采取俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上，鼻尖正中，提尾不掉。暴露前囟和人字缝，后缘暴露至正边缘，调节前囟与人字缝，使两点垂直高度一致，矢状缝居中。第四脑室定位：前囟后12.8mm、囟门腹侧6.2mm做标记，去骨及硬脑膜。放置套管，尖端到达囟门腹侧6.2mm的位置后，固定套管。实验组按照注射雌激素浓度不同分为：100nmol组、1μmol组、2μmol组，分别注射1μl雌激素溶液；对照组注射1μl人工脑脊液；空白组不注射。
1.2.2 舌下神经核团放电检测：核团定位：人字缝点后（4.900±0.020）mm、旁开（0.100±0.020）mm、囟门腹侧（8.646±0.385）mm做标记，钻孔，滴入温热石蜡油至颅骨表面。安放玻璃微电极：依据监听器的声音变化及监视器的显示基线出现突然变细现象，判断电极尖端进入石蜡油与空气相交界面，高度记录为0，将微电极缓慢推送至8000μm处出现电信号或者电位变化，再推进200μm左右观察到舌下神经核神经元自发簇发性放电特性，平稳后记录保存。
1.2.3 颏舌肌电生理检测：舌下神经核放电检测结束后，钝性分离暴露颏舌肌。用BL-420E+生物机能实验系统对SD大鼠颏舌肌进行肌电检测，检测指?宋?：动作电位、平均频率、最大频率、积分幅度、最大幅值。
1.2.4 核团位点验证：颏舌肌肌电检测后，用标记仪连接电极及大鼠头部皮肤，给予15V电压，电泳膀胺天蓝溶液至记录位点10min后拔针。灌注固定取材，确定记录位置：冰冻切片、HE染色后显微镜下观察记录位点，对照脑立体定位图谱，观察染料是否在舌下神核内（图5）。如记录位点未在舌下神经核团内，则放弃数据，补充实验。
1.3 统计学方法：所得数据使用SPSS13.0软件统计分析，采用方差分析（ANOVA）比较多组均数，SNK-q检验法比较组间均数，以P0.05）；2μmol组>1μmol组>100nmol组>对照组，组间差异有统计学意义（P理学改变对SD大鼠颏舌肌功能影响
2.2.1 颏舌肌在电刺激下，产生动作电位幅值的检测结果显示：各组之间差异无统计学意义（P>0.05）（图2），排除了颏舌肌本身功能异常对实验结果造成影响的可能。
2.2.2 颏舌肌肌电活性（平均频率、最大频率、积分幅度、最大幅度）检测结果显示：空白组与对照组无显著性差异（P>0.05），2μmol组>1μmol组>100nmol组>对照组，组间具有极显著性差异（P 3 ?论
雌激素是一种脂溶性类固醇激素，主要由卵巢合成。正常大鼠血清雌激素水平随动情周期发生变化。雌性大鼠中，雌二醇的基础水平为18.4～135.8pmol/L，在动情前期达到146.8～367pmol/L。研究发现，雌激素浓度远高于生理浓度时才能诱导雌激素的非基因组效应。本研究探讨雌激素能否从中枢途径快速影响颏舌肌肌电效应，因此设计的雌激素最低浓度为100nmol。聂培鹤等在颅内微注射雌激素，发现随雌激素浓度（0.1～1μmol/L）增加，大鼠内脏反应运动增强。
本研究利用此动物模型，采用第四脑室注射不同浓度雌激素溶液，研究雌激素调节大鼠颏舌肌生理功能的中枢途径。研究发现，注射不同浓度的雌激素药液后20min，SD大鼠舌下神经核的电生理状况发生改变，且随着雌激素浓度升高，舌下神经核自发放电频率和最大幅值明显升高。雌激素通过血液循环与靶细胞雌激素受体结合，可快速（几秒钟至数分钟）发挥生物学效应，该途径称为膜启动的类固醇信号传导（membrane initiated steroid signaling， MISS）。本研究中，雌激素可能通过MISS途径与核受体ERα的膜性成分、GPR30等中的一种或几种受体结合，快速激活第二信号系统，影响舌下神经核放电。
肌电图是将肌肉产生的动作电位变化通过生物记录系统处理后形成波形图，反应骨骼肌的活性。电刺激颏舌肌，产生的动作电位幅值与肌肉内神经核纤维数有关。结果显示，各组颏舌肌的动作电位幅值差异无统计学意义，说明选择的SD大鼠颏舌肌的神经肌肉状况一致，排除了颏舌肌本身功能异常对实验结果造成影响的可能。肌电平均频率、最大频率、积分幅度、最大幅度能有效反映颏舌肌活性特征。结果显示，随着SD大鼠颅内雌激素水平上升，舌下神经核电生理活动增强，反映颏舌肌肌电指标数值增大（表2，图3），提示雌激素可以通过改变舌下神经核电生理特性进而影响颏舌肌肌电特征。Popovic等研究发现绝经前颏舌肌肌电活动明显高于绝经后，对绝经后女性进行雌激素替代治疗，其颏舌肌电活性得到明显增强。本实验结果提示雌激素可通过中枢途径―舌下神经核影响颏舌肌功能，但雌激素引起舌下神经核电生理学改变的具体机制还需要进一步研究。
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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-07-26
编辑/张惠娟
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