2018二甲双胍治疗多囊卵巢综合征机制研究
[摘要] 目的 探?二甲双胍在治疗多囊卵巢综合征（PCOS）中对Treg细胞和Th17细胞的作用及其机制。 方法 雌性Wistar大鼠45只，来曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型，随机抽取5只确立成模后，按完全随机分组原则分为二甲双胍组、达英组、二甲双胍与达英联合治疗组及模型组，每组10只；另选取10只大鼠作为对照组。成模后，各治疗组采用相应药物灌胃治疗，模型组给予等量生理盐水，均连续处理28 d，观察各组大鼠每周体质量变化。苏木精-伊红（HE）染色法观察卵巢组织学变化，流式细胞术检测脾脏中Treg细胞和Th17细胞数量及表型的改变，ELISA法检测血清中IL-6和TGF-β水平，RT-PCR法测定卵巢组织转录因子Foxp3、ROR-γt的表达水平。 结果 模型组大鼠体质量、脾脏中Treg细胞、Th17细胞数量以及Treg/Th17比例、血清中IL-6及TGF-β水平以及卵巢组织中转录因子Foxp3的相对表达量显著高于对照组（P0.05）；二甲双胍组、达英组及联合用药组囊性扩张卵泡较模型组明显减少；二甲双胍组脾脏Treg细胞、Th17细胞、血清IL-6水平及卵巢组织中转录因子ROR-γt的表达水平较模型组显著升高（Phttp://[关键词] 多囊卵巢综合征；Treg；Th17；二甲双胍
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0017-05
Study on the mechanism of Metformin in the treatment of polycystic ovary syndrome
LU Chenyu QIN Peigang DU Hanyu WU Haixia Aihemaiti?Guliyaer AI Lixia XU Qi
Basic Medical College， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China
Objective To investigate the therapeutic mechanism of Metformin on Treg cells and Th17 cells in polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods 45 female Wister rats were gavaged by Letrozole in order to develop PCOS， and randomly chosen 5 rats to confirm the establishment of model. Then rats were divided into Metformin group ， Diane group ， Metformin combined with Diane group and model group， randomly， each group had 10 rats. The other 10 female rats were arranged as control group. PCOS rats were given corresponding drugs， while control group were administrated with physiological saline， the treatment period of all groups were 28 days. The weight changes of rats weekly were observed. Ovarian histological changes were examined by Yihong-hematoxylin staining （HE）. Flow cytometry was applied to delineate the phenotype of Treg cells and Th17 cells in spleen. ELISA was used to measure IL-6 and TGF-β in serum. The expression levels of Foxp3 and ROR-γt were measured by RT-PCR. Results The weight， the Treg and Th17 in spleen， Treg/Th17 ratio， the levels of IL-6 and TGF-β in serum， the expression of Foxp3 of PCOS model group were higher than control， with statistically significant difference （P0.05）， but significantly lower than model group （P PCOS； Treg； Th17； Metformin
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见于青春期及育龄妇女的内分泌紊乱性疾病，其主要表现为月经失调、持续性无排卵及不孕，常伴有肥胖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗等症状。PCOS在我国的患病率约为6.5%，且有逐年升高趋势。研究表明，慢性炎症能介导胰岛素抵抗（IR）的发生发展，是PCOS可能的发病因素之一。Tregs和Th17是新近发现的T细胞亚群，Treg能影响肿瘤及免疫生殖功能转归，Th17则通过分泌IL-17介导机体炎性反应，干预肿瘤发生和转移，Treg/Th17细胞之间的平衡影响多种肿瘤和炎症性疾病的发生发展。二甲双胍作为胰岛素增敏剂，用于伴有胰岛素抵抗的PCOS，但其对Treg细胞和Th17细胞的作用机制尚不清楚。本研究拟通过建立PCOS大鼠模型，观察二甲双胍对Treg细胞和Th17细胞的影响，从而进一步深入探讨二甲双胍治疗PCOS的可能机制，为临床上该药物的应用及配伍提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物造模与分组
健康雌性SPF级Wistar大鼠，6周龄，平均体重180 g，购自新疆医科大学动物实验中心，使用合格证号：65000700000624。55只大鼠适应性饲养3 d后编号，对照组10只，PCOS模型大鼠45只。PCOS模型大鼠给予来曲唑1 mg/（kg?d）连续灌胃30 d，对照组正常饲养，每周记录体质量变化。造模完成后随机抽取5只大鼠，通过阴道涂片监测其动情周期、双侧卵巢病理组织学改变评价造模效果。随后将成模大鼠按完全随机原则分为二甲双胍组、达英组、二甲双胍+达英联合用药组及模型组，每组10只。各治疗组分别使用相应药物每日1次，连续灌胃28 d；模型组给予等量生理盐水；对照组正常饲养，第28天检测各组体质量后，处死大鼠，取卵巢，电子天平称取质量。
1.2 实验药物与试剂
羧甲基醋酸纤维购自美国Sigma-Aldrich公司；来曲唑购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：H1999 1001；二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司，批号：H20023370；炔雌醇环丙孕酮片（达英-35）购自拜耳医药保健有限公司，批号：J20140114。酶联免疫试剂盒均购自Ebioscience公司；流式细胞术抗体、破膜剂和固定剂均购自美国eBioscience 公司；RNase-Free DNase I、TaKaRa SYBR？?RPremix Ex TaqTM Ⅱ购自天根生化科技有限公司。
1.3 仪器
流式细胞仪（LSRII，BD公司）；PCR扩增仪（Bio-Rad公司）；实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；荧光定量PCR检测系统（MyiQTM2 Two color Real-Time PCR Detection，Bio-Rad公司）；全波段酶标仪（Bio-Rad公司）；倒置显微镜（Olympus）等。
1.4 HE染色
处死大鼠，取卵巢，多聚甲醛中固定24 h后进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切片并进行HE染色，固定切片后，Ehrlich苏木精染色15 min，盐酸酒精溶液分色35 s，伊红染色10 min，90%乙醇分色40 s，封片，置于倒置显微镜下观察。
1.5 酶联免疫吸附实验
收集血清，按照ELISA试剂盒操作步骤进行IL-6和TGF-β检测。用特异性抗体包被96孔板，4℃冰箱过夜，加封闭液封闭非特异性结合位点，洗涤3次后加标准品及待?y血清，室温孵育2 h，洗涤后加入相应酶标二抗，室温1 h，洗涤后加入底物、显色剂。酶标仪检测450 nm处的吸光度（A）值。
1.6 流式细胞术
收集各组脾细胞悬液，分离获得单个核细胞后荧光抗体染色：将1×106细胞中分别加入抗大鼠PE标记的CD3抗体、FITC标记CD4抗体、PE-cy7标记的CD25抗体或抗大鼠PE标记的CD3抗体、FITC标记CD4抗体进行表染，之后加固定剂孵育、离心，随后加入破膜剂孵育20 min，离心后重悬细胞，分别加入抗大鼠PerCP-Cyanine 5.5标记的Foxp3抗体或PE-cy7标记的IL-17抗体，孵育20 min后离心重悬细胞；同时每个样品管均设同型对照。样品置于流式细胞仪上检测，检测结果以CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、CD4+IL-17+Th17细胞亚群的数量以及Treg/Th17比值表示。
1.7 实时荧光定量PCR
卵巢组织中Foxp3、ROR-γt的引物设计参照genebank提供的引物序列：ROR-γt正链：5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′，负链：5′-GAGGAGCCTGTGGAGAAATAC-3′；Foxp3正链：5′-ACCGTATC？鄄TCCTGAGTTCCAT-3′，负链：5′-GTCCAGCTTGACCAC？鄄AGTTTAT-3′；GAPDH正链：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，负链：5′-GGGTAGAGTCATACTGGA？鄄ACATG-3′，由上海生工生物有限公司合成。提取大鼠卵巢组织总RNA，PCR扩增后，用凝胶成像系统行光密度扫描半定量，与GAPDH密度扫描值之比，作为评价mRNA相对表达量的指标。
1.8 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P 2 结果
2.1 各组大鼠造模后一般情况
造模12 d后，大鼠阴道涂片从规律动情周期转变为无周期性，说明无排卵；对照组大鼠未出现动情周期改变。模型组大鼠平均体质量大于对照组（P0.05）；各治疗组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠卵巢质量比较及形态学观察
卵巢大体可见，对照组卵巢色泽红、表面光滑；模型组卵巢质量较对照组增大（P0.05），与模型组相比显著降低，差异有统计学意义（P0.05），而与模型组相比显著降低（P0.05），但显著低于模型组（P 综上所述，二甲双胍可降低PCOS大鼠体质量，减轻卵巢组织病理变化，其作用机制可能是通过影响血清细胞因子IL-6表达水平，调节Treg、Th17细胞数量及比例，进而改善卵巢组织微环境。本研究初步探讨了二甲双胍在治疗PCOS中对Treg/Th17的影响，为临床进一步寻找治疗PCOS新策略及利用二甲双胍治疗提供了理论依据。
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（收稿日期：2017-07-20 本文编辑：程 铭）
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