2018PNL2在黑素瘤中的表达及意义
[摘要]目的：通过检测PNL2单克隆抗体在不同类别黑素瘤中的表达情况，探讨PNL2在黑素瘤诊断中的意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测47例黑素瘤（黏膜黑素瘤11例，肢端黑素瘤24例，非肢端黑素瘤12例），10例正常皮肤组织中PNL-2，S-100，HMB-45的表达情况，分析它们与患者临床生物病理特征的关系。结果：黑素瘤组PNL-2阳性率为87.23%（41/47），正常皮肤的表达率为10%（1/10），差异有统计学意义（P0.05）；肢端和非肢端黑素瘤中PNL2与S100、HMB45的表达差异，无统计学意义（P>0.05）；黏膜黑素瘤中PNL2表达阳性率明显大于S100、HMB45（P http://[关键词]黑素瘤；PNL2单克隆抗体；黏膜黑素瘤；免疫组标记物
[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）-10-0053-04
Abstract： Objective To detect the expression of PNL2 in different types of melanoma and to explore the meaning of the auxiliary diagnosis of melanoma. Methods We detected the expression of PNL2，S100 and HMB45 in 47 cases of melanoma （11 of mucosa， 24 of acromegaly and 12 of non-acra ） and 10 cases of normal skin tissue using immunohistochemistry and analyzed their relationship with the clinical pathological characteristics. Results The positive rate of PNL2 was 87.23% （41/47） in melanoma group and 10%（1/10）in normal skin. The difference was statistically significant（P0.05）. Conclusion PNL2 is highly specific for melanoma and can be used as a new biomarker for the diagnosis of melanoma， especially for the diagnosis of mucosal melanoma
Key words： melanoma； PNL2； immunohistochemical markers
恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一种来源于黑色素细胞的恶性程度极高的皮肤肿瘤，常发生在皮肤和邻近皮肤的黏膜、眼球的色素膜和脑膜的脉络膜丛，亦可见于消化道黏膜及手足等处，它可广泛浸润皮肤表皮至皮下组织或黏膜及黏膜深层组织，甚至相邻器官，并可通过淋巴结、血道远处转移或广泛播散。近年来随着社会的发展、生活环境的改变，其发病率正在逐年增加。目前国内外的研究仍然缺少对恶性黑色素瘤的浸润转移预后及治疗的可靠指?耍?对其发生侵袭和转移的机制尚不十分清楚。恶性黑色素瘤病理诊断存在一定困难，免疫组织化学技术是诊断恶性黑色素瘤的重要辅助诊断方法，尤其对于恶性黑色素瘤的早期诊断、预后评估及治疗发展过程具有重要意义。肿瘤标记物可由肿瘤细胞产生或由非肿瘤细胞，如与肿瘤有关的免疫系统产生，可存在于细胞内或细胞表面。由于血清肿瘤标记物的检测简便易行，在肿瘤学中的应用日益广泛，但在黑素瘤中大多数血清肿瘤标记物的敏感性和特异性都不高，并且大多数在疾病晚期才高表达，因而不适于早期和亚临床期。新的黑素瘤生物标记物的发现及其临床应用价值的研究具有重要意义，通过对黑素瘤建立一种更加准确的具有治疗意义的肿瘤分期和分类方法，提高黑素瘤早期检测的准确性和可靠性。PNL2是一种研究较少的黑素瘤相关抗原单克隆抗体，我们参照少有的研究成果，根据黑素瘤的进展和是否发生转移及其组织特异性将黑素瘤分为肢端黑素瘤、非肢端黑素瘤和黏膜黑素瘤。然后用PNL2、S100、HMB45对三型黑素瘤进行染色标记，了解PNL2在黑素瘤中的表达。
1 材料和方法
1.1 材料：47例黑素瘤组织标本均来自本院皮肤科及病理科2004年12月-2014年9月存档蜡块，病史完整。全部标本均未做化疗、放疗及抗免疫治疗，经手术切除后病理学检查确诊。其中维吾尔族23例，汉族24例；男26例，女21例；年龄28～92岁，平均（61.85±13.95）岁；组织学Clark分级及发生部位情况：Ⅰ～Ⅲ级21例，Ⅳ～Ⅴ级26例；肢端黑素瘤24例，非肢端黑素瘤12例，黏膜黑素瘤11例。另选择10例普外科及整形科因外伤切除的石蜡包埋的正常皮肤组织作为对照组，对照组10例中维吾尔族5例，汉族5例；男5例，女5例。 1.2 试剂：S100单克隆抗体ab115968、HMB45单克隆抗体ab787、小鼠PNL2单克隆抗体ab12502（IgG1，上海市艾博抗贸易有限公司）；鼠兔通用型二抗，二氨基联苯胺（DAB） 显色剂均购自上海市艾博抗贸易有限公司。
1.3 方法：严格按照试剂盒说明书进行。免疫组织化学法：将10%福尔马林固定、石蜡包埋的黑素瘤组织制成4～5μm切片，常规烤片、脱蜡、水化；浸入0.01mol/L，pH值??6.0的枸橼酸盐缓冲液内，热抗原修复3min；在3%H2O2、室温下作用10min以消除内源性过氧化氢酶；滴加一抗（稀释度为1：800）；4℃过夜后在室温中复温20min；后滴加1mm EDTA缓冲液，滴加一抗（稀释度为1：10～1：25），调pH值为9.0的稀释液中进行原位染色，热抗原修复3min；室温孵育30～60min；DAB显色1min左右；自来水冲洗，苏木精复染，通透、脱水，中性树胶封片，显微镜下观察结果。PBS代替一抗作为空白对照，已知PNL2、S100、HMB45染色阳性的黑素瘤切片作为阳性对照。
1.4 评价指标：所有切片在做免疫组化前均现切现用，所有免疫组化结果由2位病理科专家双盲阅片判读结果，免疫组化阳性染色结果为大多数肿瘤细胞出现明显的细胞浆棕黄色着色，阴性为不着色或单一孤立的胞核着色、零星细胞的单一浅着色、单核巨噬细胞着色。
1.5 统计学分析：将观察数据录入到excel2014版表格中进行函数统计学分析，计数资料用率表示，比较采用χ2检验，P0.05）。
2.4 三种类型黑素瘤中S100、PNL2、HMB45的表达结果：对比各型黑素瘤中PNL2和S100，PNL2和HMB45的阳性率大小，肢端和非肢端黑素瘤中PNL2和S100，PNL2和HMB45两组的阳性率大小无统计学意义（P>0.05）；黏膜黑素瘤中PNL2染色阳性率明显大于S100、HMB45（P PNL2在黑素瘤中的阳性率与Clark分级有一定的关系，可见Clark分级偏中、晚期的黑素瘤PNL2阳性率明显高于Clark分级偏早期患者，与Ramos-Vara等提出PNL2早期免疫染色黑素瘤患者，其阳性率较低的结果一致。可见，PNL2同S100、HMB45、Melan A、Tyrosinase、MITF等黑素瘤免疫标记抗体一样，对黑素瘤早期诊断的效果欠佳。本研究年龄大于60岁的黑素瘤患者PNL-2阳性率显著高于小于60?q的患者，鉴于Mayer等的研究指出大于60岁的黑素瘤患者基础疾病较多，加上心理负担等综合因素使得他们的疾病进展较快，可能大多处于中晚期黑素瘤，故PNL2的阳性率较高。Mayer等还报道近几十年来男性由于社会、心理负担较女性大，其黑素瘤进展较快，但本研究性别对PNL2染色阳性率无影响，可能与近些年女性的社会及心理压力也逐年增长有关。
免疫组化是一种广泛用于日常病理诊断试验的一种检测技术，是一种具有精确、快速、费用低等特点。PNL2是一种研究较少的黑素瘤相关抗原单克隆抗体。其对黑素瘤具有普遍高特异性，尤其对其它标记物阳性率低的黏膜黑素瘤。因此，更多有关PNL2蛋白以及基因组的研究应受到人们的重视，以增加这种标记的临床应用，并有望用于黑素瘤的靶向治疗、预后判断、指导患者用药及为黑素瘤h患者提供最佳的个体化治疗方案。
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[收稿日期]2017-01-10 [修回日期]2017-09-20
编辑/张惠娟
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